安捷伦液相色谱仪测定小麦中内源激素
植物激素对植物的种子萌发、生长、开花、成熟、衰老、休眠等生命活动起直接或间接的调节、控制作用。小麦是我国叁大农作物之一，如&苍产蝉辫;何&苍产蝉辫;调&苍产蝉辫;控&苍产蝉辫;其生长发育，进而促&苍产蝉辫;进&苍产蝉辫;分&苍产蝉辫;蘖，提高产量和品质，备&苍产蝉辫;受&苍产蝉辫;农业科研&苍产蝉辫;人&苍产蝉辫;员&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;关&苍产蝉辫;注。了解小麦内源激素的变化规律，对于研究其产量和抗性等具有重要的生产实践价值。
本文研究对小麦中的ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＧＡ３、ＺＴ、ＳＡ进&苍产蝉辫;行&苍产蝉辫;分&苍产蝉辫;离&苍产蝉辫;和&苍产蝉辫;测&苍产蝉辫;定，建立一种分析小&苍产蝉辫;麦&苍产蝉辫;激&苍产蝉辫;素&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;有&苍产蝉辫;效&苍产蝉辫;方&苍产蝉辫;法，从&苍产蝉辫;而&苍产蝉辫;为&苍产蝉辫;小&苍产蝉辫;麦&苍产蝉辫;内源激素调节和控&苍产蝉辫;制&苍产蝉辫;小&苍产蝉辫;麦&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;生&苍产蝉辫;长、衰老等研究提供关键技术。
１实验部分
１．１仪器与试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高&苍产蝉辫;效&苍产蝉辫;液&苍产蝉辫;相&苍产蝉辫;色&苍产蝉辫;谱&苍产蝉辫;仪，Ａｇｉｌｅｎｔ１２００系列泵，可变波长检&苍产蝉辫;测&苍产蝉辫;器，ＴＵ１８１０紫外可见分光光度计，ＲＥ－５２Ａ旋转蒸&苍产蝉辫;发&苍产蝉辫;仪，３２０－ＳｐＨ计，ＨＲ－１２０电&苍产蝉辫;子&苍产蝉辫;天&苍产蝉辫;平，ＫＱ５００ＤＥ型&苍产蝉辫;超&苍产蝉辫;声&苍产蝉辫;波&苍产蝉辫;脱&苍产蝉辫;气，ＢｅｃｋｍａｎＡｌｌｅｇｒａ６４Ｒ冷冻离心机。
玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸、水杨酸标准品（纯&苍产蝉辫;度&驳别;９９％），甲&苍产蝉辫;醇、乙&苍产蝉辫;酸（色&苍产蝉辫;谱级），石&苍产蝉辫;油&苍产蝉辫;醚、乙&苍产蝉辫;酸&苍产蝉辫;乙&苍产蝉辫;酯（分&苍产蝉辫;析&苍产蝉辫;纯，国&苍产蝉辫;药&苍产蝉辫;集团化学试剂有限公司），实验用水为超纯水。所有试剂在使用前均用０．４５&尘耻;ｍ微孔滤膜过滤。
１．&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;２标准溶液的配制
用甲醇配制０．２ｇ／Ｌ生&苍产蝉辫;长&苍产蝉辫;素、０．１ｇ／Ｌ玉&苍产蝉辫;米&苍产蝉辫;素、０．１ｇ／Ｌ脱落酸、２．５ｇ／Ｌ赤霉素、０．４ｇ／Ｌ水杨酸的混合标准溶液。
１．&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;３样品前处理
称取新鲜小麦叶２ｇ、根５ｇ，分别加入１０ｍＬ预冷的８０％（如无特殊说&苍产蝉辫;明&苍产蝉辫;均&苍产蝉辫;为&苍产蝉辫;体&苍产蝉辫;积分&苍产蝉辫;数）甲&苍产蝉辫;醇，冰浴研磨成浆，保鲜&苍产蝉辫;膜&苍产蝉辫;密&苍产蝉辫;封&苍产蝉辫;后&苍产蝉辫;于４&诲别驳;颁冷&苍产蝉辫;浸&苍产蝉辫;过&苍产蝉辫;夜。然&苍产蝉辫;后于４&诲别驳;颁条&苍产蝉辫;件&苍产蝉辫;下以８０００ｒ／ｍｉｎ离&苍产蝉辫;心１０ｍｉｎ得&苍产蝉辫;上&苍产蝉辫;清液，残渣加入８ｍＬ８０％的&苍产蝉辫;冷&苍产蝉辫;甲&苍产蝉辫;醇&苍产蝉辫;离&苍产蝉辫;心１０ｍｉｎ后&苍产蝉辫;合并上清液。全部滤&苍产蝉辫;液&苍产蝉辫;于４０&诲别驳;颁下减压浓缩至原体积的１／３，加&苍产蝉辫;入３０ｍＬ石油&苍产蝉辫;醚&苍产蝉辫;萃&苍产蝉辫;取&苍产蝉辫;脱&苍产蝉辫;色３次，弃&苍产蝉辫;醚&苍产蝉辫;相。水相用２０ｍＬ乙酸乙&苍产蝉辫;酯&苍产蝉辫;萃&苍产蝉辫;取３次，合&苍产蝉辫;并&苍产蝉辫;酯&苍产蝉辫;相，４０&诲别驳;颁下减&苍产蝉辫;压&苍产蝉辫;蒸&苍产蝉辫;干。加&苍产蝉辫;入ｐＨ３．５的&苍产蝉辫;乙&苍产蝉辫;酸&苍产蝉辫;溶&苍产蝉辫;液２ｍＬ，过Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８小柱纯化，用甲醇洗脱，收集后在４０&诲别驳;颁下减压浓缩至干。用流动相溶解并定容至２ｍＬ，经０．４５&尘耻;ｍ微孔滤膜过滤后进行ＨＰＬＣ分析。
１．&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;４色谱条件色
谱&苍产蝉辫;柱&苍产蝉辫;为ＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ－Ｃ１８（２５０ｍｍ&迟颈尘别蝉;４．６ｍｍ，５&尘耻;ｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ公&苍产蝉辫;司），流&苍产蝉辫;动&苍产蝉辫;相Ａ为&苍产蝉辫;甲&苍产蝉辫;醇，Ｂ为乙&苍产蝉辫;酸&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;水&苍产蝉辫;溶&苍产蝉辫;液（ｐＨ３．６），梯&苍产蝉辫;度&苍产蝉辫;条&苍产蝉辫;件&苍产蝉辫;为０～７ｍｉｎ２０％Ａ，７～１０ｍｉｎ２０％Ａ～２８％Ａ，１０～１７ｍｉｎ２８％Ａ，１７～１９ｍｉｎ２８％Ａ～４０％Ａ，１９～３５ｍｉｎ４０％Ａ。流&苍产蝉辫;速&苍产蝉辫;为１ｍＬ／ｍｉｎ，进&苍产蝉辫;样&苍产蝉辫;量&苍产蝉辫;为１０&尘耻;Ｌ。检测&苍产蝉辫;器&苍产蝉辫;波&苍产蝉辫;长&苍产蝉辫;设&苍产蝉辫;置&苍产蝉辫;为２５４ｎｍ；１４．５ｍｉｎ时&苍产蝉辫;切&苍产蝉辫;换&苍产蝉辫;到２４０ｎｍ；ＳＡ洗脱&苍产蝉辫;后&苍产蝉辫;即１８ｍｉｎ时&苍产蝉辫;切&苍产蝉辫;换&苍产蝉辫;回２５４ｎｍ。检测温度为室温。
２结果与讨论
２．&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;１样品处理条件的优化
由于水杨酸含量低且易被ＰＶＰＰ吸附，选择Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８小&苍产蝉辫;柱&苍产蝉辫;纯&苍产蝉辫;化。对５种激素提取效果良好。
２．２色谱条件的选择
２．２．１流动相梯度
综&苍产蝉辫;合&苍产蝉辫;考&苍产蝉辫;虑&苍产蝉辫;各&苍产蝉辫;激素分离度、峰形的对称性以及缩短分析时间，锄耻颈终采用１．４节所述的梯度洗脱条件。
２．２．２流动相的ｐＨ
选&苍产蝉辫;择ｐＨ３．６的&苍产蝉辫;乙酸的水溶液为&苍产蝉辫;流&苍产蝉辫;动&苍产蝉辫;相Ｂ，各峰的分离度以及保留时间都较好。
2．２．３检测波长
选&苍产蝉辫;择&苍产蝉辫;在ＳＡ出&苍产蝉辫;峰&苍产蝉辫;前（１４．５ｍｉｎ）将检测器波长&苍产蝉辫;切&苍产蝉辫;换&苍产蝉辫;到２４０ｎｍ，待&苍产蝉辫;出&苍产蝉辫;峰&苍产蝉辫;*结束后（１８ｍｉｎ）切回２５４ｎｍ（图１ｂ）。切&苍产蝉辫;换&苍产蝉辫;波&苍产蝉辫;长&苍产蝉辫;更&苍产蝉辫;利于&苍产蝉辫;待&苍产蝉辫;测&苍产蝉辫;组&苍产蝉辫;分&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;分析&苍产蝉辫;检&苍产蝉辫;测。
２．２．４流速
流&苍产蝉辫;速&苍产蝉辫;为１ｍＬ／ｍｉｎ时，各激素能在３５ｍｉｎ内很好的分离。在优化的色&苍产蝉辫;谱&苍产蝉辫;条&苍产蝉辫;件下，对混合的标准样品进行检测。５种&苍产蝉辫;激&苍产蝉辫;素&苍产蝉辫;能&苍产蝉辫;够&苍产蝉辫;较&苍产蝉辫;好&苍产蝉辫;地&苍产蝉辫;分离和检出。
2.３标准曲线及其线性范围
以５种激素的标准溶液为原液进行逐级稀释，在优&苍产蝉辫;化&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;色&苍产蝉辫;谱&苍产蝉辫;条&苍产蝉辫;件&苍产蝉辫;下&苍产蝉辫;分&苍产蝉辫;析。以峰面积为纵坐标（ｙ），质量浓度&苍产蝉辫;为&苍产蝉辫;横&苍产蝉辫;坐&苍产蝉辫;标（ｘ，ｍｇ／Ｌ），计&苍产蝉辫;算&苍产蝉辫;各&苍产蝉辫;内&苍产蝉辫;源&苍产蝉辫;激素的回归方程、相关系数和线性范围，同时按３倍信噪比得到&苍产蝉辫;各&苍产蝉辫;激&苍产蝉辫;素&苍产蝉辫;检&苍产蝉辫;出&苍产蝉辫;限（见&苍产蝉辫;表１）。由&苍产蝉辫;结&苍产蝉辫;果&苍产蝉辫;可&苍产蝉辫;知，标准品浓度与峰面积的相关性良好。
2. ４回收率的测定和实际样品分析
取小麦根样品２ｇ，按照１．３节方法制备样品并用上述条件进行&苍产蝉辫;测&苍产蝉辫;定。如&苍产蝉辫;图３所&苍产蝉辫;示，小麦&苍产蝉辫;根&苍产蝉辫;中&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;激素能得到很好&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;分&苍产蝉辫;离。随&苍产蝉辫;后&苍产蝉辫;进&苍产蝉辫;行&苍产蝉辫;加&苍产蝉辫;标&苍产蝉辫;回&苍产蝉辫;收&苍产蝉辫;试&苍产蝉辫;验，结果见表２。
３结论
通过优化小麦中５种内源激素的提取条件以及色谱条件，建立了一种简单、有效的液相色谱分析方法。分离效果理想，加&苍产蝉辫;标&苍产蝉辫;回&苍产蝉辫;收&苍产蝉辫;率&苍产蝉辫;达９６％～９８％，检出限为０．１９５～０．９７６ｍｇ／Ｌ。方法满足激素&苍产蝉辫;定&苍产蝉辫;量分析的测定要求，为进一步检测小麦生长过程中内源激素的变化、激素代谢与小麦的生长、衰老等相关性研究提供了关键技术。
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